TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)，全內反射熒光顯微鏡，利用光從高折射率的介質(zhì)進(jìn)入較低折射率的介質(zhì)時(shí)，如果入射角足夠大時(shí)則光全部被反射而不發(fā)生折射，但是在兩種介質(zhì)的界面會(huì )產(chǎn)生衰逝波可以激發(fā)近界面100nm范圍內的熒光的原理來(lái)實(shí)現對物體表面的觀(guān)察?？赏ㄟ^(guò)常規熒光顯微鏡的照明器或特殊照明器送入激發(fā)光，并對激光的入射角度進(jìn)行控制，采用瞬間場(chǎng)激發(fā)方法以避免激發(fā)光進(jìn)入探測器，在玻璃和水界面的激發(fā)光產(chǎn)生全內反射實(shí)現的。因為激發(fā)光呈指數衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區域會(huì )產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀(guān)測標的，故此項技術(shù)廣泛應用于細胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀(guān)察。
全內反射熒光顯微鏡 (TIRFM)示意圖
?、贅悠?nbsp;②損耗波范圍 ③蓋玻片 ④浸鏡油 ⑤目標 ⑥發(fā)射光束(信號) ⑦激發(fā)光束
為了實(shí)現全內反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。這可以通過(guò)棱鏡(prism)實(shí)現，稱(chēng)為棱鏡型TIRFM(prism-based TIRFM)，也可通過(guò)高數值孔徑的物鏡實(shí)現，此時(shí)稱(chēng)為物鏡型TIRFM(objective-type TIRFM)?，F在商品化的全內反射熒光顯微鏡一般都是物鏡類(lèi)型的，速度快，精度高。
全內反射熒光顯微鏡由于能實(shí)現物體表面非常薄范圍內(小于100nm)熒光觀(guān)察，故在某些生物領(lǐng)域得到廣泛應用。如以下等應用：
細胞表面圖象的觀(guān)察：細胞膜表面結構、細胞表層的接觸、膜表面動(dòng)力學(xué)/蛋白質(zhì)定位。
單分子觀(guān)察及其操作：肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白與Cy3標記ATP。
細胞膜表面運動(dòng)：如泡吞、泡吐現象，泡外分泌現象。
細胞膜鈣火花現象的觀(guān)察，離子通道監視。
分子馬達研究：旋轉的馬達、細胞骨架蛋白、聚合體、G蛋白、環(huán)狀蛋白、核苷酸馬達。
除了在生物領(lǐng)域外，在化學(xué)領(lǐng)域等對于化學(xué)分子結構觀(guān)察中也有很好的應用。
